Eines der übergreifenden Themen der zweiten Staffel ist die anhaltende Bedrohung durch die nach wie vor geheimnisvollen Anderen. Des Weiteren werden mit einigen Überlebenden aus dem hinteren Teil des Flugzeuges neue Charaktere eingeführt und viele Geheimnisse rund um die Insel gelüftet, unter anderem das Geheimnis der Luke. Doch gleichzeitig tauchen auch wieder neue Mysterien auf, so lernen die Überlebenden beispielsweise die Dharma-Initiative kennen.

Die erste Hälfte der zweiten Staffel ist in zwei unabhängig voneinander laufende Handlungsstränge aufgeteilt. Ein Handlungsstrang behandelt die Ereignisse rund um die Luke, der andere die Erlebnisse der Floßfahrer Michael, Jin und Sawyer.

Hinter der Luke befindet sich die Schwan-Forschungsstation, in der Strom, fließendes Wasser und Nahrung vorhanden sind. Alle 108 Minuten muss die Zahlenfolge 4, 8, 15, 16, 23, 42 in einen Computer eingegeben werden, die gleichen Zahlen, die auch in Hurleys Leben bereits eine bedeutende Rolle gespielt haben. Erbaut wurde die Station, wie auch andere Stationen, die im weiteren Verlauf der Serie auf der Insel gefunden werden, von der geheimnisvollen Dharma-Initiative. Der einzige Bewohner der Forschungsstation ist ein Mann namens Desmond Hume, der dort die letzten drei Jahre verbracht hat, jedoch nun bald das Weite sucht und die Überlebenden mit der Aufgabe, die Zahlenfolge regelmäßig in den Computer einzugeben, alleine lässt. John Locke, der seit seiner wundersamen Heilung infolge des Absturzes glaubt, eine besondere Verbindung zur Insel zu besitzen, nimmt diese Aufgabe dabei anfangs besonders ernst.

Michael, Jin und Sawyer sind derweil nach der Zerstörung ihres Floßes wieder auf der Insel gestrandet, wenn auch weit entfernt von den übrigen bekannten Überlebenden. Hier treffen sie auf andere Überlebende aus dem bis dahin verschollenen hinteren Teil des Flugzeugs, von denen jedoch infolge diverser Todesfälle und Entführungen durch die Anderen nur noch fünf verblieben sind, darunter die ehemalige Polizistin Ana-Lucia Cortez, Elizabeth „Libby“, der nigerianische Priester Mr. Eko und Bernard, der Ehemann von Rose. Alle zusammen machen sich nun auf den Weg zum Lager der bekannten Überlebenden, der sie quer durch den Dschungel führt. Beim Zusammentreffen der beiden Gruppen kommt es jedoch zu einem Zwischenfall, bei dem Shannon, eine der Hauptfiguren aus der ersten Staffel, ums Leben kommt.

Wieder vereint, treffen Jack, Locke, Kate und Sawyer dabei zum ersten Mal auf die Anderen, die den Überlebenden drohen, diese sollen eine bestimmte Linie auf der Insel nicht überqueren. Kurz darauf nehmen die Überlebenden einen Mann gefangen, der zunächst von sich behauptet, ein Mann namens Henry Gale zu sein, der mit einem Heißluftballon auf der Insel abgestürzt ist. Sayid, der seinen Behauptungen nicht traut, gelingt es jedoch, „Henry“ der Lüge zu überführen. Eine weitere Station, die sogenannte Perle wird mit Hilfe einer Skizze entdeckt. Sie dient laut dem Orientierungsvideo der Überwachung der Schwan-Station über versteckte Kameras und verfügt über ein Rohrpost-System. In der Zwischenzeit hat sich Michael, der nach wie vor seinen Sohn zurückhaben will, auf einen Handel mit den Anderen eingelassen. So befreit Michael „Henry“, indem er Ana-Lucia und Libby tötet und lockt im Anschluss Sawyer, Jack, Hurley und Kate in eine Falle der Anderen. Daraufhin bekommt er tatsächlich seinen Sohn zurück und darf gemeinsam mit diesem die Insel mit einem Boot verlassen. Sawyer, Jack und Kate bleiben in Gefangenschaft der Anderen, während Hurley zurück ins Lager der Überlebenden geschickt wird.

In der Zwischenzeit hat Locke aufgrund neuerer Entdeckungen auf der Insel seinen Glauben an den Sinn seiner Aufgabe, die Zahlenfolge in den Computer einzugeben, verloren. Als er sich jedoch bewusst weigert, die Aufgabe weiter durchzuführen, und den Countdown verstreichen lässt, baut sich ein starkes elektromagnetisches Feld auf. Der mittlerweile wieder zurückgekehrte Desmond erkennt, dass ein ähnliches Ereignis einige Monate zuvor die Ursache für den Absturz des Flugzeugs gewesen war und löst in seiner Verzweiflung eine Notabschaltung aus, die zu einem gewaltigen elektromagnetischen Impuls führt und auf der ganzen Insel als helles Licht und ohrenbetäubendes Geräusch wahrgenommen wird.

Aber auch außerhalb der Insel wird dieser Impuls von einer kleinen Forschungs- bzw. Messstation registriert, woraufhin deren Insassen ihre Entdeckung an Desmonds Freundin, die seit Jahren nach ihm sucht, weiterleiten. Mit diesen Szenen, die das erste Mal seit dem Absturz die Welt außerhalb der Insel in der Gegenwart zeigen, endet die zweite Staffel.