Die dritte Staffel beschäftigt sich verstärkt mit dem Verhältnis der Überlebenden zu den Anderen. In der zweiten Hälfte gibt es zudem die ersten Kontakte zur Außenwelt.

Der in der 2. Staffel als Henry Gale vorgestellte Charakter entpuppt sich dabei als Benjamin (kurz: Ben) Linus, der Anführer jener Anderen. Anfangs werden die entführten Jack, Sawyer und Kate auf einer kleinen Insel vor der Küste der Hauptinsel von den Anderen festgehalten. Jack soll Ben einen Tumor aus dessen Rücken operieren, wobei Kate und Sawyer als Druckmittel eingesetzt werden. Aus Verzweiflung über Sawyers bevorstehende Exekution durch die Anderen schlafen Kate und Sawyer miteinander. Juliet Burke, eine der Anderen, von der sich später herausstellt, dass auch sie von Ben gegen ihren Willen auf der Insel festgehalten wird, baut ein Vertrauensverhältnis zu Jack auf und versucht, diesen dazu zu bewegen, Ben während der Operation zu töten. Tatsächlich willigt Jack schließlich in die Operation ein, verletzt Ben dabei jedoch absichtlich und erzwingt auf diese Weise die Freilassung von Kate und Sawyer. Mit Hilfe von Alex, der Tochter von Danielle Rousseau, gelingt den beiden die Flucht zurück zur Hauptinsel. Nach Beendigung der Operation kehren auch die Anderen gemeinsam mit Jack dorthin zurück.

In der Zwischenzeit erfährt der Zuschauer, dass Locke, Mr. Eko und Desmond die Implosion des Schwan-Bunkers am Ende der zweiten Staffel überlebt haben. Während Mr. Eko kurz darauf dennoch von einem Monster in Form einer Rauchwolke getötet wird, hat Locke infolge einer selbst herbeigeführten Vision seinen Glauben an die Insel wiedergewonnen. Die größten Auswirkungen hatte die elektromagnetische Entladung jedoch auf Desmond: Dieser wird − nach einer kurzfristigen Zeitreise, während der er eine entscheidende Phase seines Lebens erneut durchlebte − wiederholt von Visionen zukünftiger Ereignisse heimgesucht, die fast alle den gewaltsamen Tod Charlies in verschiedenen Situationen zum Inhalt haben, was Desmond jedoch jedes Mal erfolgreich verhindern kann. Währenddessen erfährt der Zuschauer, dass Claire die Halbschwester Jacks ist.

Nach ihrer Rückkehr ins Lager der Überlebenden bricht Kate abermals auf, um gemeinsam mit Locke, Sayid und Rousseau den nach wie vor gefangen gehaltenen Jack aus der Gewalt der Anderen zu befreien. Es stellt sich heraus, dass Jack und Juliet einen Handel mit Ben eingegangen sind, der es ihnen erlaubt, die Insel zu verlassen. Dies wird jedoch dadurch verhindert, dass Locke das U-Boot der Anderen in die Luft sprengt. Daraufhin verlassen Ben und die übrigen Anderen gemeinsam mit Locke ihr Dorf, während Kate und Sayid gemeinsam mit Jack und Juliet zu ihrem Strandlager zurückkehren. Juliet handelt dabei zunächst erneut im Auftrag Bens und soll die Überlebenden infiltrieren und einen Überraschungsangriff der Anderen vorbereiten.

In der Zwischenzeit finden Desmond, Hurley, Jin und Charlie im Dschungel eine abgestürzte Hubschrauberpilotin namens Naomi, die vorgibt, im Auftrag von Desmonds Freundin nach letzterem zu suchen. Zudem enthüllt Naomi, dass das Wrack von Oceanic Flug 815 an einem völlig anderen Ort gefunden und alle Insassen für tot erklärt worden seien. Von Naomi erhalten die Überlebenden ein Satellitentelefon, doch aufgrund eines von den Anderen eingesetzten Störsignals ist es ihnen zunächst nicht möglich, Kontakt mit dem Frachter, von dem Naomis Hubschrauber gestartet ist, aufzunehmen.

Ben weiht Locke derweil in die Geheimnisse der Insel ein und stellt ihm in einer einsamen Hütte mitten im Wald den ominösen Wohltäter der Anderen, einen gewissen Jacob, vor. Da Locke diesen jedoch weder sehen noch hören kann, will er die Hütte verärgert wieder verlassen, woraufhin ihn eine ächzende Stimme augenscheinlich um Hilfe bittet. Für den Zuschauer ist zudem für einen kurzen Moment eine menschliche Silhouette zu sehen. Locke verlässt die Hütte schließlich wieder und wirft Ben ein Täuschungsmanöver vor. Die Tatsache, dass Locke Jacob tatsächlich hören konnte, erzürnt Ben, der Locke daraufhin im Dschungel anschießt und zurücklässt.

Juliet hat Jack derweil enthüllt, dass sie im Auftrag Bens handelt, ist jedoch nunmehr entschlossen, die Seiten zu wechseln und entwickelt gemeinsam mit Jack und Rousseau einen Plan, um die Anderen, die ihr Lager überfallen sollen, in einen Hinterhalt zu locken und zu töten, was ihnen letztendlich auch gelingt. Gleichzeitig gelingt es Charlie mit der Hilfe von Desmond, das Störsignal der Anderen, das von der Unterwasserstation Der Spiegel ausgesendet wird, auszuschalten. Er nimmt Kontakt mit Desmonds Freundin Penny auf, wobei er erfährt, dass Naomi und ihre Gruppe nicht in Pennys Auftrag handeln. Charlie schließt die Tür des Kontrollraumes, um Desmond zu schützen und ertrinkt schließlich in dem sich mit Wasser füllenden Raum, so wie es Desmond vorhergesehen hat. Als warnenden Hinweis an seine Kameraden schreibt er „Nicht Pennys Schiff“ in seine Hand und zeigt es Desmond durch das Bullauge. Zur selben Zeit hat sich Ben Jack und den übrigen Überlebenden in den Weg gestellt und versucht ihn auf verschiedenen Wegen davon zu überzeugen, dass die Leute an Bord von Naomis Frachter keine freundlichen Absichten verfolgen. Auch Locke, der überraschend auftaucht und kurzerhand Naomi schwer verletzt, redet vergeblich auf Jack ein. Jack nimmt dennoch Kontakt mit dem Frachter auf.

Die dritte Staffel endet erstmalig mit einem Ausblick in die Zukunft: In einer Sequenz, die dem Zuschauer zunächst den Eindruck zu vermitteln versucht, es handle sich dabei um eine weitere Rückblende, hadert ein alkohol- und tablettensüchtiger Jack mit seinem Leben, in dem er jeglichen Halt verloren hat. Erst am Ende der Episode, als Jack sich mit Kate trifft, wird klar, dass die betreffenden Szenen nach der (in der Serie bis dahin nicht gezeigten) Rückkehr der beiden in die Vereinigten Staaten spielen. Verzweifelt versucht Jack, Kate davon zu überzeugen, auf die Insel zurückzukehren.